医学遗传学/遗传病的基因诊断举例

1．基因缺失型遗传的诊断

（1）α地贫的基因诊断：α地贫主要是由于基因缺失引起的，缺失的基因可以由1－4个。正常基因组用BamHⅠ切割，可以得到一个kb的片段，而缺失一个α基因时切点向5’端移位，得到一条10kb的片段。因此，当用α基因探针与基因组DNA进行Southern杂交时（图13-8），在α地贫₂可见一条14kb和一条10kb的带，在正常人可见一条双份的14kb的带，而在α地贫₁则见一条单拷贝的14kb带，血红蛋白H病时只有一条10kb的带的，而在Barts水肿胎时，则无任何杂交带。

图13-8 α地贫基因缺失的诊断

左图：16号染色体上携有数目不同的基因

右图：α基因探针杂交的结果

箭头：BamHⅠ切点

一种较简便的方法是直接用α探针进行斑点杂交，自显影后根据斑点深浅的不同也可以对α地贫作出诊断。更为简单的方法是PCR诊断，即在α基因缺失范围内设计一对引物，然后PCR扩增胎儿的DNA，如为Barts 水肿胎，则无扩增产物，电泳后无任何带纹，从而可建议进行人工流产，但此法不能诊断其它类型的地贫（除非另设计引物用作PCR）。

（2）DMD／BMD的缺失型诊断：DMD／BMD是一种Ⅹ连锁隐性遗传的神经肌肉系统受累的致死性遗传病（参阅第四章）。DMD／BMD有70％左右为缺失型。此基因很大，缺失可发生在不同部位，因此应尽可能采用多对引物作PCR扩增（多重PCR）来检测。如扩增产物电泳后发现有带纹的缺失，即可作出诊断并对缺失定位（图13-9），在进行产前诊断时，一般可先通过检测家系中有关成员，即确定先证者的缺失区，然后有针对性地作PCR扩增，包括缺失部分的两端，以判断胎儿或有关患儿是否也获得了相同的基因缺失，但非缺失型不能用此法查出。

2．点突变型遗传病的基因诊断2

（1）镰形细胞性贫血的基因诊断：已知突变基因是编码β珠蛋白链的第6位密码子由GAG变为GTG，从而使缬氨酸取代了甘氨酸，因此可用如下方法进行诊断。

图13-9 DMD基因缺失的多重PCR诊断

exon：外显子；pm:启动子；1：正常9条带；2：基因全缺失；3：启动子区缺失；4：第3外显了缺失；5：第13外显子缺失；6：第47外显子缺失；7：47－52外显子区段缺失；8：第52外显子缺失

1）RFLP诊断：已知限制酶MstⅡ切割的识别顺序是CCTNAGG，它能切割正常β链中CCTGAGG序列，但不能切割突变了的CCTGTGG（A→T）。这样，由于突变消除了一个切点，使内切酶长度片段发生了改变，通过电泳，就可以区别正常的β^A和β^S（图13-10）。

图13-10 镰状贫血的基因诊断

除MstⅡ外，限制酶DdeⅠ（识别序列为CTNAG）也能够把正常的β^A基因与镰变了的β^S基因区别开来，并用于诊断。

2）ASO探针诊断：由于突变部位和性质已完全明了，也可以合成寡核苷酸探针，用³²P标化来进行诊断。此时需要合成两种探针，一种与正常β^A基因序列完全一致，能与之稳定地杂交；另一种与突变基因序列一致，能与β^S基因稳定杂交，但不能与正常的β^A基因杂交。根据杂交结果，就可以把发生了突变的β^S基因检测出来。

PCR技术问世以来，ASO诊断又有新的改进，即先PCR扩增长约110bp的基因片段，然后再与ASO探针杂交。这样可减少目的基因DNA用量，并降低与基因组DNA杂交时的非特异性信号。

3．基因异常不明的遗传病的诊断

成年型多囊肾病（adult polycystic kidney disease,APKD）是一种常染色体显性遗传病，发病率高，约1000人中有1名致病基因的携带者，起病较晚，多在30岁以后，主要为肾和肝中出现多发性囊肿，临床表现为腰疼、蛋白尿、血尿、高血压、肾盂肾炎、肾结石等，最终可导致肾功能衰竭和尿毒症。本病基因定位在16p13，与α珠蛋白基因3’端相邻，但致病基因尚未克隆，基因产物的生化性质和疾病发病机理也尚未阐明。因此，目前只能用连锁分析来进行基因的发病前诊断和产前诊断。由于通过家系分析，已证实APKD的致病基因与α珠蛋白基因3’端附近的一段小卫星DNA序列即3’HVR(3’ hypervariable region)紧密连锁，而后者在人群中具有高度多态性，因此可以通过RFLP连锁分析进行诊断（图13-11）。

图13-11 成年型多囊肾病的连锁分析诊断

从图13-11可见，当用3’HVR作为探针与PvuⅡ酶切后的家系有关成员基因组DNA杂交时，可见有5.7、3.4和2.4kb的3种等位片段。患者的母亲有5.7和3.4kb两种片段，父亲为2.4kb纯合子，其子女凡有3.4片段者为患者，而凡无此片段者都不是患者。因此可知致病基因伴随3.4kb等位片段分离，即与之相连锁。图中Ⅱ₅的DNA检查只有5.7和2.4kb而无3.4kb片段，故不是患者或致病基因携带者。